睫状神经营养因子缓释微囊的制备及表征

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.34.008

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (34): 5455-5460.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.34.008

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睫状神经营养因子缓释微囊的制备及表征

李小丽，王明波，陈昌盛，佘振定

深圳清华大学研究院生物医用材料及植入器械重点实验室，广东省深圳市 518057

修回日期:2014-06-30 出版日期:2014-08-20 发布日期:2014-08-20
通讯作者: 佘振定，博士，副研究员，深圳清华大学研究院生物医用材料及植入器械重点实验室，广东省深圳市 518057
作者简介:李小丽，女，1984年生，内蒙古自治区赤峰市人，汉族，2010年北京化工大学毕业，硕士，工程师，主要从事缓释生物医用材料、骨科生物医用材料方面的研究。
基金资助:
深圳市生物、互联网、新能源产业发展专项资金(CXB201104250055A)

Preparation and characterization of ciliary neurotrophic factor sustained-release microcapsules

Li Xiao-li, Wang Ming-bo, Chen Chang-sheng, She Zhen-ding

Key Laboratory of Biomedical Materials and Implants, Research Institute of Tsinghua University in Shenzhen, Shenzhen 518057, Guangdong Province, China

Revised:2014-06-30 Online:2014-08-20 Published:2014-08-20
Contact: She Zhen-ding, M.D., Associate researcher, Key Laboratory of Biomedical Materials and Implants, Research Institute of Tsinghua University in Shenzhen, Shenzhen 518057, Guangdong Province, China
About author:Li Xiao-li, Master, Engineer, Key Laboratory of Biomedical Materials and Implants, Research Institute of Tsinghua University in Shenzhen, Shenzhen 518057, Guangdong Province, China
Supported by:
the Special Fund by Shenzhen for Biology, Internet and New Energy Resources Development, No. CXB201104250055A

摘要/Abstract

摘要：

背景：睫状神经营养因子眼部给药非常困难且药物生物利用度较低，需要长期连续给药，为解决这一问题，可将其包封在选择性透过膜中形成微囊，利用膜的选择透过性释放囊内的生物活性物质或活体细胞分泌的生物活性分子和小分子代谢产物。

目的：制备具有特殊结构的睫状神经营养因子缓释微囊。

方法：将聚醚砜中空纤维膜的一端用医用胶紫外光固化封口，再将睫状神经因子从另一端注入聚醚砜微囊中，并用医用胶紫外光固化封口，制得睫状神经营养因子缓释微囊。将缓释微囊浸提液与小鼠成纤维细胞L929共培养，考察微囊的细胞毒性；将小鼠视网膜色素上皮细胞与缓释微囊共培养，考察细胞在缓释微囊表面的黏附性；将睫状神经营养因子缓释微囊浸泡在生理盐水中考察其降解性；同时考察在聚醚砜中空纤维囊中免疫球蛋白IgG和睫状神经营养因子的体外释放行为。

结果与结论：睫状神经营养因子缓释微囊的内径约为398 μm，壁厚约为145 μm，囊壁的外层由疏松大孔构成，内层呈现许多微小的囊孔，孔径约10 nm，在生理盐水中4个月基本无降解，具有良好的细胞相容性。聚醚砜中空纤维囊对蛋白的释放具有选择透过性，能选择性释放睫状神经因子，有效阻隔球状抗体IgG。同时，缓释微囊改善了以往给药体系的突释行为，睫状神经营养因子只在中间阶段呈现较小程度的突释，然后呈现平稳释放。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 缓释材料, 睫状神经营养因子, 缓释微囊, 聚醚砜, 释放曲线

Abstract:

BACKGROUND: Conventional ophthalmic delivery of ciliary neurotrophic factor (CNTF) is extremely difficult to pass the blood-retinal barrier, resulting in a very low bioavailability and the need of long-term drug delivery. To solve the problem, the CNTF can be encapsulated in a semi-permeable membrane to form a microcapsule, which may then achieve the release of bioactive substances encapsulated, or bioactive molecules secreted by living cells and small molecular metabolites through semi-permeability of the special membrane.

OBJECTIVE: To prepare a special structural CNTF sustained-release microcapsule.

METHODS: A selected poly(ether sulfone) hollow fiber was cut into 1 cm long with its two ends sealed by 1181-M medical adhesive using UV curing. To prepare CNTF encapsulated microcapsule, one end was first sealed, and then the CNTF was loaded to poly(ether sulfone) microcapsule from the other end which then was sealed. The leaching liquor of sustained-release microcapsule was co-cultured with mouse fibroblast L929, to observe the cytotoxicity of the microcapsule. The sustained-release microcapsule was co-cultured with mouse retinal pigment epithelial cells, to observe the cell adhesion ability of the microcapsule. The CNTF sustained-release microcapsule was immersed in physiological saline, to observe the degradability. Moreover, in vitro release behavior of immunoglobulin and CNTF were evaluated.

RESULTS AND CONCLSION: The CNTF sustained-release microcapsule had an inner diameter of about 398 μm and a membrane thickness of about 145 μm. The microcapsule presents a lot of macropores in the outer wall and many 10 nanometers micropores in the inner wall. The sustained-release microcapsule was not degraded in saline within 4 months, indicating good cell compatibility. The microcapsule can selectively release CNTF while protecting against invading of antibodies (IgG), showing its good selective permeability. Meanwhile, the sustained-release microcapsule improved the initial burst release of traditional drug delivery vesicles. The microcapsule presents a mild sudden release in the middle stage, and then a sustained release.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Key words: ciliary neurotrophic factor, delayed-action preparations

中图分类号:

R318

李小丽，王明波，陈昌盛，佘振定. 睫状神经营养因子缓释微囊的制备及表征[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(34): 5455-5460.

Li Xiao-li, Wang Ming-bo, Chen Chang-sheng, She Zhen-ding. Preparation and characterization of ciliary neurotrophic factor sustained-release microcapsules[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(34): 5455-5460.

图/表（结果） 2

2.1 CNTF缓释微囊微观结构形貌 CNTF缓释微囊的微观形貌如图1所示，外层由很多疏松的大孔构成(图1A，B)，内层的囊孔较密集，孔径为10 nm左右(图1C)，满足其半渗透性的孔径要求。利用ImageJ软件对10根CNTF缓释微囊100个不同位置的内径及壁厚进行测量，结果显示纤维囊的内径为(398.0±12.6) μm，壁厚(145.0±20.9) μm。本实验制备微囊的直径为Thanos等^[33]报道的NT501中聚醚砜中空纤维囊直径的一半，增加了表面积/体积比。

2.2 CNTF缓释微囊的生物相容性评价 阴性对照组的A值为0.634±0.091，CNTF缓释微囊的A值为0.651±0.094，由相对细胞存活率公式得细胞的存活率为102.68%，根据GB/16886标准细胞毒性评价，CNTF缓释微囊的细胞毒性为0级。利用小鼠视网膜上皮细胞黏附在CNTF缓释微囊内壁24，72 h后，对细胞进行Live-Dead染色，由图2可知活细胞在CNTF缓释微囊内壁上黏附数量明显增多，因此，CNTF缓释微囊内壁有利于促进细胞增殖、黏附生长，具有良好的生物相容性。

2.3 CNTF缓释微囊的体外降解性能 为了探究CNTF缓释微囊在眼科植入体内的降解，采用生理盐水为模拟眼液研究了缓释微囊的体外降解性能。由图3降解质量曲线可知，在4个月内CNTF缓释微囊的质量前后相差不大，在误差范围内，可认为基本无降解。因此，CNTF缓释微囊具有良好的稳定性。

2.4 CNTF缓释微囊的体外释放曲线 将一定量CNTF与模拟蛋白IgG分别加载至PES中空纤维膜中，考察它们的在微囊中的体外释放行为。由图4A可知，在前7 h，CNTF基本呈现零释放，这可能是由于CNTF透过内壁的微孔及数百微米的厚壁需要一定的时间所致。经历这段时间后，累积的CNTF在7-24 h内呈现短暂的突释，其后从第2天至第7天以缓和的速度平稳释放，并在第7天达到65%的释放量。而对于模拟蛋白IgG，体外释放7 d内的测试A值均与空白样的A值相接近(图4B)，可认为在测量误差范围内，IgG基本无释放，不能通过微囊内壁的微孔。因此，特制结构的聚醚砜微囊对于蛋白的释放具有选择性。

参考文献

[1] Tao W.Application of encapsulated cell technology for retinal degenerative diseases.Expert Opin Biol Ther.2006;6(7): 717-726.
[2] Vervoort R,Wright AF.Mutations of RPGR in X-linked Retinitis Pigmentosa (RP3).Hum Mutat.2002;19:486-500.
[3] 董晓,佘华宁.视网膜色素变性疾病治疗进展及研究现状[J].国际眼科杂志,2011,11(4):633-636.
[4] 艾明,孙明,李岱.视网膜色素变性的治疗进展[J].国际眼科杂志, 2010,10(7):1324-1326.
[5] 蒋沁,曹国凡,胡红莉.视网膜色素变性的研究进展[J].眼视光学杂志,2006,8(2):126-130.
[6] Bustos M,Moreno-Aliaga MJ,Prieto J.Cardiotrophin-1: a new player in energy metabolism with potential therapeutic application. Aging (AlbanyNY).2011;3(8):698-699.
[7] Sale A,Roy Chowdhury SK,Smith DR,et al.Ciliary neurotrophic factor activates NF-κB to enhance mitochondrial bioenergetics and prevent neuropathy in sensory neurons of streptozotocin-induced diabetic rodents. Neuropharmacology. 2013;65:65-73.
[8] Sleeman MW,Anderson KD,Lambert PD,et al.The ciliary neurotrophic factor and its receptor, CNTFR alpha.Pharm Acta Helv.2000;4(2-3):265-272.
[9] 李陶,陈意生,王禾.睫状神经营养因子、雪旺氏细胞与周围神经再生[J].国外医学:临床生物化学与检验学分册,2001,22(1): 25-27.
[10] Kang SS,Keasey MP,Arnold SA,et al.Endogenous CNTF mediates stroke-induced adult CNS neurogenesis in mice. Neurobiol Dis.2013;49C:68-78.
[11] Askvig JM,Leiphon LJ,Watt JA.Neuronal activity and axonal sprouting differentially regulate CNTF and CNTF receptor complex in the rat supraoptic nucleus.Exp Neurol. 2012; 233(1):243-252.
[12] Adler R,Landa KB,Manthorpe M,et al.Cholinergic neuronotrophic factors: intraocular distribution of trophic activity for ciliary neurons. Science. 1979;204(4400): 1434-1436.
[13] Barbin G,Manthorpe M,Varon S.Purification of the Chick Eye Ciliary Neuronotrophic Factor.J Neurochem.1984; 43(5): 1468-1478.
[14] Masiakowski P,Liu HX,Radziejewski C,et al.Recombinant Human and Rat Ciliary Neurotrophic Factors.J Neurochem.1991;57(3):1003-1012.
[15] Lim GJ,Zare S,Van DM,et al.Cell micro-encapsulation.Adv Exp Med Biol.2010;670:126-136.
[16] LaVail MM,Unoki K,Yasumura D,et al.Multiple growth factors, cytokines and neurotrophins rescue photoreceptors from the damaging effects of constant light. Proc Natl Acad Sci U S A.1992;89(23):11249-11253.
[17] Roger J,Brajeul V,Thomasseau S,et al.Involvement of Pleiotrophin in CNTF-mediated differentiation of the late retinal progenitor cells.Dev Biol.2006;298:527-539.
[18] LaVail MM,Yasumura D,Matthes MT,et al.Protection of mouse photoreceptors by survival factors in retinal degenerations. Invest Ophthalmol Vis Sci.1998;39(3):592-602.
[19] Gaudana, R,Jwala J,Boddu SH,et al.Recent perspectives in ocular drug delivery. Pharm Res.2009;26(5):1197-1216.
[20] Santos E,Orive G,Calvo A,et al.Optimization of 100 μm alginate-poly-L-lysine-alginate capsules for intravitreous administration. J Control Release.2012;158(3):430-450.
[21] Montanucci P,Pennoni I,Pescara T,et al.The functional performance of microencapsulated human pancreatic islet-derived pre-cursor cells. Biomaterials. 2011; 32: 9254-9262.
[22] Rokstada AMA,Lacíkb I,de Vosc P,et al.Advances in biocompatibility and physico-chemical characterization of microspheres for cell encapsulation.Adv Drug Del Rev.2014; 67-68:111-130.
[23] Mendes AC,Baran ET,Reis RL,et al.Fabrication of phospholipid–xanthan microcapsules by combining micro?uidics with self-assembly.Acta Biomaterialia.2013;9(5): 6675-6685.
[24] Wang MB,Feng QL,Niu XF,et al.A spheres-in-sphere structure for improving protein-loading poly(lactide-co-glycolide) microspheres.Polym Degrad Stabil.2010;95:6-13.
[25] Brun-Graeppi AK,Richard C,Bessodes M,et al.Cell microcarriers and microcapsules of stimuli-responsive polymers.J Control Release.2011;149(3): 209-224.
[26] Weiner AL,Gilger BC.Advancements in ocular drug delivery.Vet Ophthalmol.2010;13(6):395-406.
[27] Checa-Casalengua P,Jiang C,Bravo-Osuna I,et al.Retinal ganglion cells survival in a glaucoma model by GDNF/Vit E PLGA microspheres prepared according to a novel microencapsulation procedure.J Control Release.2011;156(1): 92-100.
[28] Murua A,Portero A,Orive G,et al.Cell microencapsulation technology: Towards clinical application.J Control Release. 2008;132(2):76-83.
[29] Brun-Graeppi AK,Richard C,Bessodes M,et al.Cell microcarriers and microcapsules of stimuli-responsive polymers. J Control Release.2011;149(3):209-224.
[30] Emerich DF,Orive G,Thanos C,et al.Encapsulated cell therapy for neurodegenerative diseases: From promise to product. Adv Drug Del Rev. 2014;67-68:131-141.
[31] Unger RE,Huang Q,Peters K,et al.Growth of human cells on polyethersulfone (PES) hollow fiber membranes.Biomaterials. 2005;26(14):1877-1884.
[32] 夏泽坤,吕晓龙.聚醚砜中空纤维膜透析性能研究[J].天津工业大学学报, 2007, 26(2):10-13.
[33] Thanos CG,Bell WJ,O'Rourke P,et al.Sustained secretion of ciliary neurotrophic factor to the vitreous, using the encapsulated cell therapy-based NT-501 intraocular device. Tissue Eng.2004;10(11-12):1617-1622.

引言

伴随着年龄增长，眼科疾病发病率普遍增高，常见的眼科疾病有视网膜病、青光眼、色素性视网膜炎等^[1]。色素性视网膜炎是一种由基因变异而引起的遗传性疾病。患有视网膜色素变性的患者表现为夜盲、视野偏窄，并且随着时间的推移会出现视觉凝障，最后视力逐渐消失导致失明^[2]。目前对于色素性视网膜炎的临床治疗方法主要有中医药活血化瘀、针刺及按摩等综合治疗法，虽可以延缓疾病发展，但并不能阻止疾病的发展和导致的最终结果^[3]。近年来，利用基因治疗、药物治疗、视网膜移植等方法治疗色素性视网膜炎取得了一系列的进展和成果。基因治疗主要针对突变点进行还原替代治疗和转录表达神经生长因子基因，但基因治疗的长期疗效、免疫反应等尚不清晰，需要进一步研究证实^[3-4]。视网膜移植是将视网膜中发生病变的部分用正常的来取代，有可能改善视功能，但对于用视网膜移植治疗色素性视网膜炎病变尚需大量的工作。药物治疗法是目前比较成熟的方法，常用的药物有神经营养因子、维生素A、牛磺酸和二十二碳六烯酸。维生素A、牛磺酸和二十二碳六烯酸对色素性视网膜炎的治疗主要起防治作用。神经营养因子对色素性视网膜炎中感光细胞凋亡的神经具有保护作用，色素性视网膜炎发展的最终阶段即感光细胞凋亡，而利用载体技术将神经营养因子转运到感光细胞处，利用这些因子推迟或控制感光细胞的凋亡，最终可以达到治疗色素性视网膜炎的目的^[5]。

睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF) 由许旺细胞分泌，具有促进神经元存活和分化，防止受损神经元退变，促进轴突再生等重要作用^[6-11]。CNTF是最早发现于鸡胚眼体中间的一类特异性蛋白^[12]，它在睫状体、虹膜当中都具有较高含量，并且可以维持睫状神经元纤维生存。1984年Barbin从鸡的眼组织中纯化出CNTF，这种酸性蛋白的相对分子质量为20 400。实验中发现这种纯化的神经营养因子能够使得分离后的睫状神经节细胞和从某些小鸡、啮齿类动物体内分离出来的交感神经节细胞在体外存活24 h以上^[13]。Masiakowski等^[14]在1991年克隆了位于第11对常染色体11q12上的人CNTF基因，研究发现人类CNTF基因与大鼠和兔有80%的同源性，同时实验证明基因重构后表达的CNTF蛋白和大鼠提取的CNTF蛋白具有相同的生物活性，两者均能够促进从胚胎鸡提取睫状神经的存活及其轴突再生。

诸多研究表明，CNTF对于治疗干型或湿型老年黄斑变性^[15-16]、视网膜色素变性^[17]、青光眼和视网膜静脉闭塞等眼科疾病具有一定的作用^[18]。传统的治疗方式是将CNTF注射到玻璃体中，然而由于视网膜位于眼睛的玻璃体之后，并且CNTF是由活体细胞分泌具有生物活性的蛋白质，很难通过血-视网膜屏蔽，药物生物利用度往往较低，导致需要长期连续给药，造成治疗色素性视网膜炎的效果不佳，增大了成本^[19]。

为解决这一问题，人们将具有生物活性的蛋白或特异性细胞包封在选择性透过膜中形成微囊，利用膜的选择透过性释放囊内的生物活性物质或活体细胞分泌的生物活性分子和小分子代谢产物^[20-21]，取得了一定的治疗效果。目前，这类缓释微囊主要有聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球、海藻酸近球形微囊等^[22]。Mendes等^[23]用磷脂和黄胶原自组装合成一种两亲性多糖，利用微流平台将细胞封装在两亲性多糖胶囊中，研究结果表明细胞封装的胶囊稳定，细胞在胶囊中存活超过21 d，显示出良好的应用前景。Wang等^[24]制备了壳聚糖包被聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球的多核复合核壳微球，并研究了其释放行为，发现该复合微球基本没有突释现象，并且延长了药物的释放周期。活性生物因子经微囊化后，可以避免被机体降解，保持生物活性，实现在体内长效释放^[25]。Weiner等^[26]利用新型乳化溶剂萃取技术(S/O/W)，制备了胶质细胞源性神经营养因子/维生素E聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球，能够有效保护胶质细胞源性神经营养因子蛋白的活性。但由于机体是一个复杂的环境，除了生物降解外，机体中抗体的作用也会很大程度地降低生物活性分子的活性，影响治疗效果^[27-28]。因此，设计可有效阻隔抗体的聚合物微胶囊在药物控释系统方面具有更广泛的应用前景^[29-30]。

聚醚枫是一种具有良好化学稳定性、耐热性、耐压力、耐腐蚀性的可用于净水和分离的半透膜，在生物医学领域常被用于蛋白质、细菌等的分离，获得美国FDA认证。聚醚砜中空纤维是一种良好的基质，有利于人各种细胞的增殖和铺展^[31]。夏泽坤等^[32]制备相同壁厚不同内径的聚醚砜中空纤维膜，研究了不同孔径对小分子蛋白的清除。研究结果表明纤维内径为0.26 mm的膜对尿素和溶菌酶的清除率分别为88.6%和62.79%，对牛血清白蛋白的截留率可达到98%以上；有研究制备一种复合羟基磷灰石的聚醚砜混合基质膜，当羟基磷灰石的添加量为60%时，复合膜的孔径约为40 nm，复合膜对牛血清白蛋白具有较强的吸附能力，纯化了牛血清白蛋白。

为了能够有效阻隔抗体，更好地保护生物活性分子并改善以往药物载体的突释行为，本实验选用具有一定微孔结构及良好稳定性的聚醚砜纤维膜，经过特殊处理制备装载CNTF的中空纤维囊，通过研究其结构、体外药物释放性能及阻隔抗体的效果等，探讨该中空纤维囊给药系统的应用前景。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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材料方法

设计：材料制备及缓释实验。

时间及地点：于2012年2月至2013年12月在深圳清华大学研究院生物材料实验室完成。

材料:

实验方法：

CNTF缓释微囊的制备：将聚醚砜中空纤维膜制成 1 cm长度，一端用1181-M医用胶紫外光固化封口，再用微量注射器将480 μg/L的睫状神经因子从另一端注入聚醚砜中空纤维膜中，并用1181-M医用胶紫外光固化封口，即制得CNTF缓释微囊。

CNTF缓释微囊形貌：取一段CNTF缓释微囊，浸渍在液氮中脆断，将样品黏附在样品板的导电胶上，真空干燥后用扫描电子显微镜观察。再取一段CNTF缓释微囊，放入液氮中，静置3 min，用锋利的手术刀片将微囊剖开，将微囊的横截面黏附在导电胶上，真空干燥后喷金用扫描电子显微镜观察。

CNTF缓释微囊内表面结构分析：取一段CNTF缓释微囊，用锋利的手术刀片将微囊剖开，展平，然后黏附在载玻片上，自然晾干后用原子力显微镜观察其内表面结构。

CNTF缓释微囊的细胞毒性分析：称取一定量的CNTF缓释微囊，置于装有DMEM培养基的离心管中浸提，浸提比例为0.1 g/mL，在37 ℃恒温箱(转速为60 r/min)中浸提24 h；阴性对照组为不含材料浸渍液的浸提液；阳性对照组为含0.64%苯酚的培养液；将浸提液无菌过滤后，加入96孔板，每孔100 μL，再加入成纤维细胞L929悬液，细胞种植浓度为1 000个/孔，将96孔板置于CO₂培养箱，空白对照组为不含细胞的DMEM培养液；培养24 h后加入MTT溶液，避光37 ℃孵育4 h，每孔再加入50 μL二甲基亚砜，避光显色15 min，在450 nm波长下，用酶标仪检测A值。相对细胞存活率公式如下：

根据GB/16886标准细胞毒性评价，相对细胞存活率在80%-100% 之间，毒性为0级；在60%-79% 之间，毒性为1级；在40%-59%之间，毒性为2级；在20%-49%之间，毒性为3级；在0%-19%之间，毒性为4级。

CNTF缓释微囊的细胞黏附性分析：用医用胶将1 cm CNTF缓释微囊黏附在2 cm×2 cm的玻璃片上，电子束灭菌(15 kGy，0.5 h)。将灭菌后的样品用PBS浸泡0.5 h，弃去原液，加入1640培养基浸泡0.5 h，将处理后的样品移至24孔板，再将小鼠视网膜上皮细胞悬液滴加到样品上，细胞浓度为4.8×10⁸ L^-¹，将24孔板置于CO₂培养箱，培养24 h后用2.5%戊二醛固定2 h，再用体积分数100%，95%，85%，70%，50%的乙醇梯度脱水，每一浓度脱水5 min，真空干燥24 h后喷金，用扫描电子显微镜观察CNTF缓释微囊上的细胞黏附情况。

CNTF缓释微囊的体外降解：称取100 mg 左右的CNTF缓释微囊，并将材料置于装有60 mL生理盐水的聚乙烯瓶中，然后置于37 ℃恒温箱(转速为60 r/min)中进行降解实验。在预设的时间点取样，用去离子水进行清洗3 d，每天换3次水，然后将清洗后的样品真空干燥并测其质量，每个时间点3个平行样品。

CNTF缓释微囊的体外释放行为：

模拟体液的制备：在烧杯中加一定量的去离子水，置于37 ℃ 水浴中，按照顺序将 6.662 g NaCl、2.268 g NaHCO₃、0.228 g KCl、0.277 g CaCl₂、0.305 g MgCl₂•6H₂O、0.228 g K₂ HPO₄•3H₂O、0.071 g Na₂SO₄等依次加入到去离子水中，配制1 000 mL的模拟体液。注意加入 MgCl₂•6H₂O后，用HCl调节溶液pH值使溶液呈弱酸性，然后再加入其他原料至全部溶解，最后加入(CH₂OH)₃CNH₂作为缓冲溶液调节溶液的pH值为7.4。

将CNTF缓释微囊置于装有3 mL模拟体液的离心管中，置于37 ℃恒温箱(转速为60 r/min)中进行释放实验。在预设的时间点，吸取0.25 mL上清液用于分析该时间点CNTF的浓度，同时加入新鲜的 0.25 mL模拟体液，继续置于恒温箱。将取出的样品置于-20 ℃条件下保存待测。CNTF浓度用小鼠CNTF Eilsa试剂盒检测。再取长为1 cm的聚醚砜中空纤维膜，一端用1181-M医用胶紫外光固化封口，再用微量注射器将1 g/L的IgG从另一端注入聚醚砜纤维膜中，并用1181-M医用胶紫外光固化封口，即制得载有IgG的聚醚砜微囊，同时将IgG缓释微囊按照上述步骤进行体外释放行为研究，用BCA试剂盒检测IgG浓度(A值)。以时间为横轴，释放百分率或A值为纵轴拟出CNTF及IgG释放曲线，每个时间点均取3个样品，以标准偏差表示。

主要观察指标：CNTF缓释微囊的细胞毒性、细胞黏附性、降解性及体外释放行为。

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[1]	李黎, 马力. 磁性壳聚糖微球固定化乳糖酶及其酶学性质[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 576-581.
[2]	周安琪, 唐渝菲, 吴秉峰, 向琳. 骨膜组织工程设计：共性与个性的结合[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3551-3557.
[3]	郎丽敏, 何生, 姜增誉, 胡奕奕, 张智星, 梁敏茜. 导电复合材料在心肌梗死组织工程治疗领域的应用进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3584-3590.
[4]	刘鋆, 杨龙, 王伟宇, 周玉虎, 吴颖, 卢涛, 舒莉萍, 马敏先, 叶川. 聚3-羟基丁酸酯4-羟基丁酸酯/聚乙二醇/氧化石墨烯组织工程支架的制备和性能评价[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3466-3472.
[5]	解健, 苏俭生. 静电纺丝取向纳米纤维作为组织工程生物支架的优势与特征[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(16): 2575-2581.
[6]	纪琦, 喻正文, 张剑. 3D打印金属基生物材料工艺和临床应用的问题与趋势[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(16): 2597-2604.
[7]	宋涯含, 吴云霞, 范道洋. 基于VOSviewer生物医学领域3D打印的知识图谱分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(15): 2385-2393.
[8]	钱楠楠, 张潜, 杨睿, 敖俊, 章涛. 间充质干细胞治疗脊髓损伤：细胞治疗及联合新药和生物材料[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(13): 2114-2120.
[9]	罗雅馨, 毕浩然, 陈晓旭, 杨琨. 细胞外基质与组织的再生与修复[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(11): 1785-1790.
[10]	贾巍, 张满栋, 陈维毅, 王晨艳, 郭媛. 股骨假体材料对人工膝关节置换性能的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(10): 1477-1481.
[11]	王倩, 李璐, 舒静媛, 董志恒, 靳友士, 王青山. 氧化锆基纳米羟基磷灰石功能梯度生物材料的微观形貌和物相分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(10): 1517-1521.
[12]	杨亚楠, 李峻峰, 王立, 刘恒全, 赖雪飞. 柠檬酸钙：一种有趣的有机钙生物医用材料[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(10): 1609-1615.
[13]	王刚, 李东辉, 白志明. 长段输尿管损伤替代治疗的方法、材料及修复重建的演变历程[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1299-1305.
[14]	李黎, 马力, 李鹤. 磁性壳聚糖微球的制备及表征[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(4): 577-582.
[15]	唐萌萌, 陈和春, 谢宏晨, 张瑜, 谭晓霜, 孙艺璇, 黄毅娜. 聚(L-丙交酯-ε-己内酯)/交联聚乙烯吡咯烷酮输尿管支架植入大鼠膀胱后的组织相容性[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(4): 583-588.